Introduktion til biofilm

Specielle emner


Hvad er en biofilm?

Biofilm er en fællesbenævnelse for en gruppe strukturer der går fra en simpel udspredning af et lag bakterier på en overflade til komplekse 3D-strukturer der interagerer med både de underliggende overfladestrukturer og medier der passerer hen over overfladen [20]. For den almindelige borger, refererer biofilm sædvanligvis til bakterievækst, men det er reelt en række organismer der også indeholder, alger, gærsvampe, mug og svampe.

Grunden til at biofilm er et problem er, at bakterier og andre mikroorganismer, som sidder på overfladen, enten ødelægger overfladen eller afgiver skadelige stoffer eller organismer til omgivelserne, eller en kombination af de tre. Slutresultatet er sædvanligvis, under alle omstændigheder, ødelagt udstyr/isenkram og ødelagte produkter.

Den grundliggende proces for dannelsen af biofilm er relativt simpel. Detaljerne i processerne er i bedste fald dårligt forstået, men dannelsen sker i fem trin [11]:

  1. Reversibel vedhæftning. Cellerne sætter sig løseligt fast på overfladen. På dette stade kaldes cellerne planktonic cells, og refereres til som free-flowing eller stationary-phase for at markere forskellen på før og efter vedhæftningen.
  2. Irreversibel vedhæftning. Cellerne limes fast til substratet og danner begyndende celleklynger. De forankrede celler kaldes sessile cells.
  3. Modning trin 1. Celleklyngerne modnes og bliver løbende lagdelt. En belægning af exopolysaccharider begynder at dannes. Quorum-sensing signaling is activated.
  4. Modning trin 2. Efter en periode med vækst har celleklyngerne nået deres maksimale tykkelse.
  5. Dispersion. Bevægelige celler svømmer væk fra de indre dele af celleklyngerne. Den tilbageværende celleklynge ændrer sig pga. hulrummene efterladt af cellerne.
Modellen er kendt som Marshall-modellen. Detaljerne i dannelsen af biofilm såsom tidsrammen for hvert trin og de samlede cellers morfologi er afhængig af de involverede mikroorganismer og alle parametre som mikroorganismer og miljø er udsat for.



Effekten af biofilm-dannelsen

Dannelsen af biofilm er mest kendt fra medierne i forbindelse med utilstrækkelig rengøring på hospitaler [f.eks. 3, 4], bakterier i mad (især fjerkræ [f.eks. 6]) og drikkevand [f.eks. 5, 19, 21], og skimmelsvampe i huse [f.eks. 1]. I hospitalssektoren er bakterielle infektioner også en stort problem i forbindelse med behandling af sår, implantater og medicinsk udstyr [f.eks. 16, 18, 23].

Den primære bekymring mht. dannelsen af biofilm er ikke den biologiske vækst som sådan, men snarere sideeffekterne.

Nogle bakterier producerer exotoksiner, dvs. toksiner som de afgiver til miljøet, f.eks. Exotoxin A fra Pseudomonas aeruginosa og botulinum neurotoxin A fra Clostridium botulinum, og det er disse som er farlige. Denne type bakterier er kendte som patogene bakterier, og patogene mikroorganismer i almindelighed er almindeligvis refereret til som patogener.

Andre bakterier producerer slimede, beskyttende lag og/eller metabolitter, som giver fødevarer en grim smag eller frastødende lugt. Selv om de ikke nødvendigvis er farlige, er fødevaren stadig ødelagt.

Når man ser på biologisk vækst, er det derfor vigtigt at skelne mellem dem der udgør en sundhedsfare, og dem der kun får ting til lugte eller smage dårligt eller op anden måde være ubehagelig.

En af de mindre kendte effekter af biofilm, er nedbrydningen af substratet de sidder på. Fænomenet har været kendt i mere end 50 år, inden for nogle områder, men er først i den senere tid blevet accepteret som vigtigt [12]. Problemet har vist sig at være ret udbredt, fra skulpturer i sten [22] over vandledninger i metal [10] til polymerer som polycarbonat [7].

Nedbrydningen af substratet er, som den toksiske effekt og ødelæggelsen af organisk materiale som fødevarer, et biprodukt af mikrobens biokemiske processer. For de uorganiske substrater menes det at være en del af de biokemiske redox-reaktioner [10, 12] mens det for de organiske polymerer menes det at være et biprodukt af enzymatisk nedbrydning af enten andre organiske materialer, f.eks. når blødgøreren i polymeren bruges som carbonkilde, eller mikroben der udskiller nedbrydende enzymer eller oxiderende affaldsprodukter [7, 27].

Indlysende nok, idet den enes nød er den andens brød, er biofilm ikke altid et problem, selv om det er det man typisk fokuserer på. Bionedbrydelige polymerer som PLA bruges til suturer og stents der nedbrydes i kroppen [25], enkapsulering til controlled release af medicin, ligeledes i kroppen [28], samt bionedbrydelige pakkematerialer [8].



Strategier til forebyggelse af biofilm-dannelse

Fordi dannelsen af biofilm er et stort problem, betyder det, at der tages forholdsregler for at forhindre dannelsen. Det kritiske trin i Marshall-modellen er trin 2, hvilket betyder at det mest lønsomme i forhold til at forhindre biofilm-dannelse er at forhindre bindingen af proteiner til overfladen. Alternativet til denne proces er, at have en overflade som er toksisk for mikroorganismen, og dermed stoppe processen ved trin tre.

Der er ikke nogen endelig løsning på hindringen af biofilm-dannelsen, andet end en fornyende overflade som menneskers hud og slimhinder. Overfladen der forhindrer bindingen af en bakteriestamme vil være den perfekte overflade for en anden stamme. Det ligger alt sammen i materialeinteraktionen mellem bakteriens bindingsprotein og overfladen. På den anden side, er bakteriestammerne som en overflade oplever ofte begrænset til nogle få typer, specielt ved produktionsfaciliteter, og derfor kan valget af materiale til udstyret have en enorm indflydelse på problemerne med biofilm.

Den klassiske tilgang til håndtering af dannelsen af biofilm har været rengøringsprocedurerne. Imidlertid har eksperimenter med f.eks. klorin på glas-, cement-, MDPE- og PVC-rør i vandforsyningssystemer vist at mens klorin kan reducere dannelsen af biofilm, er reduktionen i biofilm fra ændring af rørets materiale meget større end for rengøringsmidlet [14]. Selv om rengøringsprocedurer er vigtige, skal det primære fokus være på valget af det rigtige materiale for at forhindre væksten af biofilm.

Den anvendte tilgang til forhindringen af dannelsen af biofilm er en strategisk overvejelse, afhængig af de tilgængelige teknologier og regler og forordninger for produktet og produktionsudstyret.

Inden for forhindringen af mikrobiel vedhæftning, giver teknologien tre grundliggende indgangsvinkler:
Angrebsvinklen afspejler i sagens natur i nogen grad form og funktion af produkt og produktionsudstyr.

At have et bulk-materiale med de ønskede antimikrobielle egenskaber er langt den bedste løsning. Det reducerer antallet af procestrin for at lave genstanden, og hvis materialet nedbrydes eller krakelerer, bibeholder den nye overflade de antimikrobielle egenskaber. Effekten bliver dæmpet lidt, hvis den antimikrobielle egenskab kommer fra en leachable substance. I dette tilfælde vil den antimikrobielle egenskab falde indtil NOAEL (No Observable Adverse Effect Level) er nået for mikroben.

Da forebyggelsen af bakteriel vedhæftning er et overfladefænomen, er det muligt at bruge en overfladebelægning eller en beskyttende film. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at man kan bruge ét materiale til at få de rigtige egenskaber til bulkmaterialet, og en anden for at få de rette egenskaber på overfladen. Ulempen er en begrænsning i mængden af antibakterielt middel som kan inkorporeres i materialet og en følsomhed over for ridser i overfladen.

Adskillige eksperimenter har vist, at det at have et antibakterielt middel i enten coating eller bulkmaterialet vil hæmme eller periodevis forhindre dannelsen af biofilm [13, 15, 18, 24]. Brugen af et udsivende antibakterielt middel er imidlertid et spørgsmål om national lovgivning, og denne ændres over tid, så anvendelsen af denne fremgangsmåde skal til en hver tid være afklaret i forhold til gældende lovgivning og regulativer.

At vælge det rette materiale er en kompleks sag, og stærkt afhængig af den tiltænkte anvendelse, f.eks. det betyder ikke noget at den antibakterielle coatning på et urinkateter er begrænset til nogle få dage ved brug, det er et engangsprodukt, som kun anvendes i ca. 10 minutter. Rør til drikkevand, som er i brug i årtier, kan ikke være afhængige af en antibakteriel effekt, som kun holder i dage eller endda nogle få år.

Forsøg med bakterien Legionella pneumophila i varmt vand i rør af kobber, rustfrit stål og PEX (tværbundet polyethylen) demonstrerede kompleksiteten i problemet med valg af materiale til reduktion af bakterievækst. I begyndelsen viste kobber en signifikant reduktion, sammenlignet med de to andre materialer. Som korrosionsprodukter begyndte at vise sig på kobberoverfladen (carbonater og hydroxider) blev den antibakterielle effekt reduceret til den nåede samme niveau som rustfrit stål og PEX [26].

Andre forsøg med Aureobasidium pullulans har vist, at blødgørerne DOP og DOA (hhv. dioctyl-phthalat og dioctyl-adipat) øger vedhæftningen af blastosporer til PVC-overfladen. Effekten ses både ved blødgjort PVC og ikke-blødgjort PVC med blødgøreren i vækstmediet [27]. Med andre ord: kombinationen af rørets materialet og væsken kan øge, og dermed også hæmme, dannelsen af biofilm.

Designet af udstyret/emnet er også et kardinalpunkt i forhold til dannelsen af biofilm. Et forsøg med Teflonpakninger i rørføringer til mejeriprodukter viste, at mælk vil nedbryde Teflonoverfladen og gøre den splintret og krakkeleret. Dannelsen af biofilm blev observeret i fordybningen hvor pakningen mødte rørene, hvorfra de voksede ud ad [9]. Det vides, at Teflon har en begrænset hæmmende effekt på bakterievækst [18], men effekten ophæves af steder hvor bakterier kan blive efterladt og have tid til at blive hængt fast til krævende overflader. Effekten forstærkes yderligere, hvis området er svært eller umuligt at få adgang til under rengøringsprocedurerne.



Strategier for fjernelse af biofilm

Biofilm vil blive dannet på et tidspunkt. Valget af det rette materiale og design vil fø processen til at gå langsommere og endda gøre biofilmen lettere at fjerne, men biofilm vil dukke op på et eller andet tidspunkt.

Den klassiske tilgang til at fjerne biofilm er afrensning med sæbe eller desinficeringsmiddel. Sterilisering med varme (autoklave), UV-lys, elektronstråling eller antibiotika/biocid er også meget almindelig inden for nogle områder. Pris og praktiske overvejelser som størrelsen på genstanden der skal renses, begrænser disse specifikke metoder. Forudsat at genstanden er tilstrækkelig billig, anvendes strategien med engangsprodukter, hvor produktet smides ud efter brug (f.eks. kanyler og endagskontaktlinser).

En relativt ny og lovende version af brugen af varme til sterilisering er Sono-Steam®-metoden. Her bliver genstandens overflade udsat for en kombination af damp og ultralyd, hvilket dræber bakterierne på overfladen, men bulkmaterialet efterlades uberørt [2].

Ved valg af strategi for at fjerne den dannede biofilm, er det et godt råd, at starte med at bestemme hvilken type film der skal fjernes, ikke kun bakteriestammen. Forsøg med en række antibakterielle midler har vist, at midlets effektivitet afhænger af filmens region. Et forsøg med antibiotika viste, at antibiotika som tobramycin, ciprofloxacin og tetracycline overvejende dræber bakterien i cap-delene af svampeformede strukturer, mens colistin, SDS, gallium og EDTA overvejende dræber bakterier i stilk-delen af svampeformede strukturer [20].

En fuldstændig fjernelse af biofilm, er ikke nødvendigvis det samme som at materialet vender tilbage til sin oprindelige tilstand. Forsøg med sterilisering og geninficering af polymerer inficeret med Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus, viste, at de steriliserede materialer er mere modtagelige for dannelsen af biofilm. Dette antages at være rester af polymer fra biofilmen, som gør overfladen lettere at gro på. Forsøgene med anvendelsen af varme og UV til sterilisering viste, at varme vil ændre overfladen på gummi så materialet bliver endnu mere modtageligt for vækst end før [17].

For af fjerne biofilm, skal man således overveje at kombinere flere rengøringsprocedurer, og vor visse materialer, som polymerer, kan det være billigere at skifte den inficerede del end at rense den.



Love og regulativer

Brugen af biocider til forebyggelse af dannelse af biofilm, afhænger af applikationen og landet hvor produktet produceres og sælges. Love og regulativer opdateres også jævnligt i takt med at nye materialer dukker op og ny information om eksisterende materialer bliver tilgængelig. Man bør derfor til en hver tid være opdateret om de specifikke love og regulativer der gælder for produktet og markedet.

På samme måde som forebyggelsen af biofilm er underlagt love og regulativer, er fjernelsen af biofilm underlagt love og regulativer, og på samme måde som ved forebyggelsen af biofilm, er reglerne og regulativerne specifikke for både applikationsområdet og landet.

Selv om ingen regel er hugget i sten, er der et par tommelfingerregler, som bør anses for universelle:



For at gøre en lang historie kort

Biofilm kommer af mikroorganismer som får mulighed for at sætte sig fast på en overflade. Hvordan biofilmen udvikler sig, afhænger af typen af mikroorganisme, overfladeegenskaberne og de omgivelsesmæssige ting, som filmen oplever (temperaturer, næringsstoffer, toksiner, etc.). Mikroorganismer vil komme til at sidde fast på overfladen på et eller andet tidspunkt. I den efterfølgende dannelse af biofilm, eller forhindringen af dette, er ingen faktor i miljøet irrelevant.

At slippe af med biofilmen kan gøres ved at rense overfladen eller smide den kontaminerede genstand ud. Fremgangsmåde afhænger af love og regler i det land hvor produktionen finder sted, og landet hvor produktet bliver solgt.

Selv for produkter of produktionsudstyr hvor tilstedeværelsen af mikroorganismer of biofilm ikke er et problem i forhold til sikkerhed, bør dannelsen af biofilm holdes nede på et minimum, da biofilm vides at degradere/ødelægge overfladen de sidder fast på.

Designet af produktionsudstyr og produktet, og materialet det anvendes til disse, bør afspejle en risikovurdering af den type biofilm som er mest sandsynlig, eller som man ved, vil dukke op, og procedurerne der anvendes, eller tiltænkes at anvende, for at fjerne/rense for biofilmen.

At holde dannelsen af biofilm på et minimum for både produkter og produktionsudstyr kræver således en kombination af
  1. at kunne forudsige hvilke typer af mikroorganismer der med størst sandsynlighed vil dukke op som biofilm, eller identifikation af mikroorganismen, hvis filmen allerede er dannet,
  2. design af produktionsudstyr of produkter til minimal vedhæftning og vækst af mikroorganismer, og
  3. design af produktionsudstyr og produkter der tillader effektive renseprocedurer.



Referencer

1: Skimmelsvamp skal frem i lyset
Berlingske Tidende, 7. Maj, 2008

2: FORCE Sono-Steam - High-speed microbial reduction
FORCE Technology. Product Datasheet 2664-2-en

3: Bakterieepidemi er overstået
Jyllandsposten, 6. april, 2009

4: Hospitaler ramt af super-bakterie
Jyllandsposten, 19. marts, 2009

5: Forurenet drikkevand i sommerhusområde
Jyllandsposten, 24. november, 2008

6: Bakterier i det meste importerede fjerkræ
Jyllandsposten, 9. november, 2008

7: Artham, T., Doble, M.
Biodegradation of aliphatic and aromatic polycarbonates
Macromol. Biosci. (2008) 8 14-24

8: Auras, R., Harte, B., Selke, S.
An overview of polylactides as packaging materials
Macromol. Biosci. (2004) 4 835-64

9: Austin, J.W., Bergeron, G.
Development of bacterial biofilms in dairy processing lines
J. Dairy Res. (1995) 62 509-519

10: Beech, I.B., Sunner, J.A., Hiraoka, K.
Microbe-surface interactions in biofouling and biocorrosion processes
Int. Microbiol. (2005) 8 157-168.

11: Carnazza, S., Satriano, C., Guglielmino, S., Marletta, G.
Fast exopolysaccharide secretion of Pseudomonas aeruginosa on polar polymer surfaces
J. Colloid Interface Sci. (2005) 289 386-393.

12: Coetser, S.E., Cloete, T.E.
Biofouling and biocorrosion in industrial water systems
Crit. Rev. Microbiol. (2005) 31 213-32

13: Goddard, J.M., Hotchkiss, J.H.
Rechargeable antimicrobial surface modification of polyethylene
J. Food Prot. (2008) 71 2042-2047

14: Hallam, N.B., West, J.R., Forster, C.F., Simms, J.
The potential for biofilm growth in water distribution systems
Water Res. (2001) 35 4063-4071

15: Ji, J., Zhang, W.
Bacterial behaviors on polymer surfaces with organic and inorganic antimicrobial compounds
J. Biomed. Mater. Res. A (2009) 88 448-453

16: Kestler, M., Reves, R., Belknap, R.
Pacemaker wire infection with Mycobacterium tuberculosis: a case report and literature review
Int. J. Tuberc. Lung. Dis. (2009) 13 272-274

17: Kétyi, I.
Biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa and by Staphylococcus aureus on model medical devices
Acta Microbiol. Immunol. Hung. (1995) 42 221-227

18: Liedberg, H., Ekman, P., Lundeberg, T.
Pseudomonas aeruginosa: adherence to and growth on different urinary catheter coatings
Int. Urol. Nephrol. (1990) 22 487-492

19: Mead, P.S., Slutsker, L., Dietz, V., McCaig, L.F., Bresee, J.S., Shapiro, C., Griffin, P.M., Tauxe, R.V.
Food-related illness and death in the United States
Emerg. Infect. Dis. (1999) 5 607-625

20: Parsek, M.R., Tolker-Nielsen, T.
Pattern formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms
Curr. Opin. Microbiol. (2008) 11 560-566

21: Rayner, M., Scarborough, P.
The burden of food related ill health in the UK
J. Epidemiol. Community Health. (2005) 59 1054-1057

22: Scheerer, S., Ortega-Morales, O., Gaylarde, C.
Microbial deterioration of stone monuments--an updated overview
Adv. Appl. Microbiol. (2009) 66 97-139

23: Schweinberger, M.H., Roukis, T.S.
Wound complications
Clin. Podiatr. Med. Surg. (2009) 26 1-10

24: Shi, Z., Neoh, K.G., Kang, E.T.
Antibacterial activity of polymeric substrate with surface grafted viologen moieties
Biomaterials (2005) 26 501-508

25: Talja M, Välimaa T, Tammela T, Petas A, Törmälä P.
Bioabsorbable and biodegradable stents in urology
J. Endourol. (1997) 11 391-7

26: van der Kooij, D., Veenendaal, H.R., Scheffer, W.J.
Biofilm formation and multiplication of Legionella in a model warm water system with pipes of copper, stainless steel and cross-linked polyethylene
Water Res. (2005) 39 2789-2798

27: Webb J.S., Van der Mei, H.C., Nixon. M., Eastwood, I.M., Greenhalgh, M., Read, S.J., Robson, G.D., Handley, P.S.
Plasticizers increase adhesion of the deteriogenic fungus Aureobasidium pullulans to polyvinyl chloride
Appl. Environ. Microbiol. (1999) 65 3575-3581

28: Wischke, C., Schwendeman, S.P.
Principles of encapsulating hydrophobic drugs in PLA/PLGA microparticles
Int. J. Pharm. (2008) 364 298-327